脐带间充质干细胞诱导成骨及治疗骨缺损

中国组织工程研究与临床康复

摘要

背景：人脐带间充质干细胞在成骨及组织器官修复方面具有更强的扩增能力及低免疫原性，其成集落生长潜能及成骨时间早于骨髓等其他来源间充质干细胞。

目的：观察脐带间充质干细胞诱导成骨及移植治疗骨缺损的临床效果。方法：应用组织块贴壁法提取人脐带间充质干细胞，体外行成骨诱导并通过光镜观察、茜素红染色、碱性磷酸酶染色、Ⅰ型胶原的表达等证实其体外成骨能力；对临床骨缺损病例行人脐带间充质干细胞移植，移植后定期复查骨缺损部骨痂生长状况。

结果与结论：体外诱导证实人脐带间充质干细胞具有明确的成骨作用。骨缺损患者在人脐带源间充质干细胞移植后2个月X射线见左股骨髁上骨折部位骨块间隙模糊，骨折外周形成明显的骨痂，骨折断端相连，断端骨折线依然存在；移植后3个月见骨痂间已经形成明显骨性连接。证实脐带间充质干细胞具有体外诱导成骨及体内移植修复骨缺损作用。

关键词：人脐带间充质干细胞；干细胞移植；骨不连；骨缺损；诱导

doi:10./j.issn.-..45.

0引言

人脐带间充质干细胞具有来源丰富，分离、提取简单、细胞生长旺盛、传代稳定、体外诱导成骨高效等特点，通过对体外免疫学研究，证实其不表达同种异体的白细胞抗原B7因子，具有同种异体移植的免疫耐受特征[1].自脐带间充质干细胞被发现至今，中外学者已经进行相当多的研究。其具有的低污染、来源充足、增殖旺盛及等特点吸引了众多的研究者。既往的研究资料中脐带间充质干细胞在成骨及其他组织器官修复方面均表现出优良的种子细胞特征，具有更强的扩增能力及低免疫原性，其成集落生长潜能及成骨时间早于骨髓等其它来源的间充质干细胞，并具有明确的基因工程及细胞遗传学研究的应用价值。

脐带间充质干细胞除形成文献中的脂肪、骨、软骨成分外，还能生成骨骼肌组织并在修复光感受器研究中证实具有其他来源间充质干细胞无法比拟的优势[2-7].

既往资料中脐带间充质干细胞优良的成骨性能不仅在体外实验室中得以证实，并且在大量的动物实验中也得以证实。然而由于伦理学医疗管理方面的限制，临床上应用脐带间充质干细胞移植治疗骨折延迟愈合及不愈合的报道寥寥无几，本院获权开展对其研究以来，证实了脐带间充质干细胞在体外诱导成骨，病对临床骨缺损的患者进行体内移植，取得修复巨大骨缺损的作用。

1对象和方法

设计：体外细胞学观察，细胞移植临床试验。

时间及地点：于医院进行。

对象：36岁男性患者，车祸致左股骨髁上开放性、粉碎性骨折伴骨缺损，入院后当夜于腰硬联合麻醉下给予清创、钢板内固定，术后30天后行骨缺损植骨，一直跟踪随访至术后8个月，未见明显骨折愈合，见图1。

于年11月在本院行人脐带间充质干细胞移植。患者对治疗前均知情，并签订知情同意书。

脐带来源：医院妇产科，均为健康的产妇足月剖腹产胎儿的脐带，实验获得产妇及其家属知情同意。实验医院伦理委员会审批。

骨缺损治疗过程：

腰硬联合麻醉，按原切口暴露股骨髁上骨折及骨缺损部位，仔细清除移植骨块间的纤维连接，彻底止血并反复冲洗切口，应用事先准备好第5代人脐带间充质干细胞1×数量级自体含高浓度血小板血浆(血浆离心，抽取血浆与红细胞接触层面中上部分)共同注入移植骨块及骨折间隙，见图4，观察5min，待混合有脐带间充质干细胞的高凝血浆形成静止胶冻状覆盖于骨块及填充满骨折间隙，逐层缝合切口，术后给予石膏后托固定2周。术应用抗生素3d预防感染，全身及局部未见明显感染征象后停止抗生素应用。

主要观察指标：①脐带间充质干细胞诱导成果结果。②临床观察患者一般状况，包括体温、切口状况及定期复查的X射线片，观察骨痂生长的状况。

2结果

2.1人脐带间充质干细胞成骨诱导结果

诱导第7天见诱导培养体系中人脐带间充质干细胞形态已发生明显变化，由培养前的多角形及短梭形变为短柱状，伸出较多的伪足，培养板上见大量的折光性强的结节析出，见图5。

成骨诱导的菌素红染色：成骨诱导体系染色见大量的红色钙盐结晶析出于人脐带间充质干细胞之间，钙盐结节呈方形或多边形，折光性强，见图6。

成骨诱导的碱性磷酸酶染色：通过碱性磷酸酶的直接染色，见诱导组细胞胞核染成均一蓝色，胞浆内细胞核旁淡蓝色异染阳性颗粒，见图7。

Ⅰ型胶原的表达结果：通过Ⅰ型胶原的免疫组织化学染色，见诱导组细胞胞核蓝染，在核旁胞浆内见暗黑(深棕色)的阳性异染颗粒，见图8。

2.2人脐带间充质干细胞移植治疗骨缺损的临床效果移植后2个月摄片见左股骨髁上骨折部位骨块间隙模糊，骨折外周形成明显的骨痂，骨折断端相连，但断端骨折线依然存在，见图9；3个月摄片复查：见骨痂间已经形成明显骨性连接，见图10。

2.4不良反应：细胞移植后体温正常，移植后临床观察患者体温、检测术后血常规，生命体征及切口状态，无明显不良反应。

3讨论

理想的骨组织工程种子细胞应具备以下特点：取材方便，对机体损伤小；体外培养易定向分化为成骨细胞并具有较强的稳定传代增殖能力；植入体内能适应局部环境并保持较强的成骨活性[8]。

作者选用简单易行的组织块贴壁法，根据实验观察，此方法提取成功率高、方法简单、提取后细胞纯度较高、不含杂质细胞等优点。在脐带来源无菌的条件下，其提取成功率为%。在培养体系内无需加入双抗及生长因子，生长状况非常活跃。

人脐带间充质干细胞呈多角形与长梭型，贴壁生长，增殖旺盛，传20代仍未见其形态及生长状态的改变。资料显示：人脐带间充质干细胞通过组织块贴壁法获得后能在26代之前保持原有的形态学特点及增殖状态，体现人脐带间充质干细胞旺盛的生长能力及稳定传代的特征，作者总结资料并对其原因给予解释：脐带间充质干细胞具有胚胎干细胞的特点，通过检测，证实其表达Oct-4，

Sox-2，Rex-1，SSEA-3，SSEA-4，Tra-1-60等多种原始状态细胞的标记，可见其原始性要高于其他来源间充质干细胞[9]；脐带间充质组织内含有大量的IGF-I、FGF、PDGF、EGF等因子，对人脐带间充质干细胞的生长具有良好的促进作用，并且对血管化的形成及各类临床修复都能起到很好的作用。此外，大量的胶原及氨基葡聚糖等存在各种因子促进细胞的扩增、分化及合成。由此可见细胞外基质在控制人脐带间充质干细胞生长调控方面也起一定的作用[10]。

人脐带间充质干细胞体外成骨诱导方面：

观察7天时见细胞形态呈短柱状及方形，符合成骨细胞的形态特点。一般认为：Ⅰ型胶原、碱性磷酸酶、骨钙素或钙结节的形成为成骨细胞的鉴定及功能评价的指标[11]，实验也针对以上指标进行验证，碱性磷酸酶染色、Ⅰ型胶原免疫组化染色及茜素红染色阳性结果，提供人脐带间充质干细胞经诱导后成骨分化的直接证据。在诱导分化过程中可见分化中的人脐带间充质干细胞数量减少，而对照组呈集落样、生长旺盛。结合资料，未分化人脐带间充质干细胞对surviv-in、hTERT及Bcl-2的表达和他们在体外的存活及扩增关系密切，诱导分化中的人脐带间充质干细胞以上因子表达下降导致其失去高度扩增的潜能。在分化后其增殖的潜能将受到明显的抑制，可见呈分化状态的人脐带间充质干细胞不会无限制的扩增，体现其定向分化后能够避免成肿瘤样无限制繁殖的移植安全性。患者植骨后8个月在骨缺损处未见骨痂形成及骨折愈合，但在移植人脐带间充质干细胞后3个月即可见到骨痂的形成及骨性连接，验证人脐带间充质干细胞移植的治疗效果。患者因长期关节固定出现明显的关节功能受限，骨缺损的修复为以后功能锻炼打下良好的基础。骨折临近的关节是否能得到早期功能练习，避免关节僵硬及肌力障碍等可能是更重要的问题，骨折延迟愈合必将推迟对临近关节及肌力练习的时间和强度。作者通过本例骨缺损的治疗得到的直接经验是：如骨缺损植骨同时行人脐带间充质干细胞移植可缩短骨折愈合时间，使患肢能早期进行功能练习。关于人脐带间充质干细胞移植临床应用国内外报道较少，其关键问题在于获权准入的限制，本院从年获得准入以来，开展其基础及临床治疗骨延迟愈合及不愈合的研究[12]，并显示出明显的治疗效果。本文中病例为本院首次针对骨缺损治疗成功的范例，并再次证实应用自体含高浓度血小板血浆作为介质在骨缺损中明确的治疗作用[13]，为今后开展临床干细胞移植治疗骨缺损提供可行的参考资料。因此，人脐带间充质干细胞具有体内外成骨，并对骨折延迟愈合、不愈合、骨缺损等具有明确的治疗效果，但其最终的临床治疗方法尚存在问题：移植所致骨折愈合后形成骨痂的强度是否能达到一期骨折愈合的标准，移植的数量级大小与骨折愈合时间、愈合效果的关系；远期是否出现肿瘤等尚需进一步基础及临床研究证实。

4参考文献

[1]YeXY,LiXJ,XuY,etal.ZhongguoZuzhiGongchengYanjiuyuLinchuangKangfu.,13(36):-.野向阳,李相军,徐岩,等.人脐带间充质干细胞体外成骨及其免疫学特征[J].中国组织工程学研究与临床康复,,13(36):-.

[2]RomanovYA,SvintsitskayaVA,SmirnovVN.Searchingforalternativesourcesofpostnatalhumanmesenchymalstemcells:candidateMSC-likecellsfromumbilicalcord.StemCells.;21(1):-.

[3]LüLL,SongYP,WeiXD,etal.Comparativecharacterizationofmesenchymalstemcellsfromhumanumbilicalcordtissueandbonemarrow.ZhongguoShiYanXueYeXueZaZhi.;16(1):-.

[4]HonsawekS,DhitiseithD,PhupongV.Effectsofdemineralizedbonematrixonproliferationandosteogenicdifferentiationofmesenchymalstemcellsfromhumanumbilicalcord.JMedAssocThai.;89Suppl3:S-.

[5]KermaniAJ,FathiF,MowlaSJ.CharacterizationandGeneticManipulationofHumanUmbilicalCordVeinMesenchymalStemCells:PotentialApplicationinCell-BasedGeneTherapy.RejuvenationRes..[Epubaheadofprint]

[6]BakshD,YaoR,TuanRS.Comparisonofproliferativeandmultilineagedifferentiationpotentialofhumanmesenchymalstemcellsderivedfromumbilicalcordandbonemarrow.StemCells.;25(6):-.

[7]LundRD,WangS,LuB,etal.Cellsisolatedfromumbilicalcordtissuerescuephotoreceptorsandvisualfunctionsinarodentmodelofretinaldisease.StemCells.;25(3):-.

[8]ConnollyJF.Injectablebonemarrowpreparationstostimulateosteogenicrepair.ClinOrthopRelatRes.;():8-18.

[9]JoCH,KimOS,ParkEY,etal.Fetalmesenchymalstemcellsderivedfromhumanumbilicalcordsustainprimitivecharacteristicsduringextensiveexpansion.CellTissueRes.;(3):-.

[10]SobolewskiK,Ma?kowskiA,BańkowskiE,etal.Whartonsjellyasareservoirofpeptidegrowthfactors.Placenta.;26(10):-.

[11]GuoLD,WangJ,XiaB,etal.ShengmingdeHuaxue.;25(3):-.郭立达,王捷,夏冰,等.骨髓基质干细胞向成骨细胞的定向诱导分化[J].生命的化学,,25(3):-.

[12]QuZG,MiSF,FangGJ.ZhongguoXiufuChongjianWaikeZazhi.;23(3):-.曲志国,米树峰,房国军.经皮脐带源MSCs移植治疗骨不连[J].中国修复重建外科杂志,,23(3):-.

[13]KitohH,KitakojiT,TsuchiyaH,etal.Transplantationofmarrow-derivedmesenchymalstemcellsandplatelet-richplasmaduringdistractionosteogenesis--apreliminaryresultofthreecases.Bone.;35(4):-.

ISSN-CN21-/RCODEN:ZLKHAH

扫描订阅：细胞王国

互动

欢迎点击文章最末端“写留言”互动交流

转载请注明：http://www.mqkpm.com/ysxg/1186.html